Biegowelove.pl

informacje o Polsce. Wybierz tematy, o których chcesz dowiedzieć się więcej

Naukowcy opracowują wysokowydajną, bezkomórkową platformę do badań przesiewowych do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2

Naukowcy z Northwestern University w USA opracowali niedawno wysokowydajną zautomatyzowaną platformę do badań przesiewowych do szybkiej identyfikacji przeciwciał SARS-CoV-2 przeciwko ciężkiemu ostremu zespołowi oddechowemu. Badanie jest już dostępne pod adresem bioRxiv* Serwer przygotowania do druku.

tło

Terapeutyczne przeciwciała monoklonalne opracowane przeciwko białku szkieletowemu SARS-CoV-2 stały się obiecującą interwencją w leczeniu pacjentów z nowym koronawirusem 2019 (COVID-19). Podobnie wykazano, że przeciwciała wytwarzane w odpowiedzi na szczepionki COVID-19 są wysoce skuteczne w zapobieganiu zakażeniom SARS-CoV-2 i chorobom objawowym. Poza zastosowaniem terapeutycznym, przeciwciała są szeroko stosowane w testach immunologicznych do szybkiego wykrywania antygenów wirusowych.

Obecnie używane platformy przesiewowe są wykorzystywane do identyfikacji przeciwciał specyficznych wobec antygenu skierowanych przez Evolution lub izolowania klonów z pojedynczych komórek B od osobników odzyskanych z COVID-19 lub zakażonych zwierząt. Izolacja, ocena i identyfikacja najlepszego kandydata na przeciwciało wymaga szeregu czasochłonnych i pracochłonnych eksperymentów, w tym klonowania, transfekcji, ekspresji białek na bazie komórek, oczyszczania białek i oceny wiązania. Czas trwania tych procedur waha się od tygodni do miesięcy. Ponadto procedury te często wykazują niską skuteczność w identyfikowaniu silnych przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2.

W bieżącym badaniu naukowcy opracowali zautomatyzowaną platformę do wykrywania przeciwciał, która łączy bezkomórkową syntezę białek z wysokoprzepustowym testem interakcji białko-białko.

Platforma do wykrywania przeciwciał o wysokiej przepustowości

Platforma łączy cztery główne etapy, w tym składanie i amplifikację bezkomórkowego DNA, bezkomórkową syntezę białek, amplifikowany i jednorodny test immunosorbentu oraz zautomatyzowany przepływ pracy przy użyciu robotów i płynów dźwiękowych. Zastosowane w badaniu systemy bezkomórkowej syntezy białek mogą generować przeciwciała bezpośrednio z liniowych matryc DNA. Podobnie, test immunologiczny może szybko scharakteryzować oddziaływanie białko-białko bez potrzeby oczyszczania białka.

Platforma zajmuje tylko 24 godziny, aby przeszukać i rozróżnić setki przeciwciał związanych z określonym antygenem. W celu walidacji funkcjonalnej naukowcy wykorzystali tę zautomatyzowaną platformę do badań przesiewowych do przetestowania panelu 120 wcześniej zidentyfikowanych przeciwciał ukierunkowanych na białko szkieletowe SARS-CoV-2.

READ  Naukowcy ogłaszający kryzys klimatyczny twierdzą, że parametry życiowe Ziemi uległy pogorszeniu

Przepływ pracy z wysokowydajnym, wolnym od komórek testem przeciwciał. a, Schematyczny diagram etapów związanych z przepływem pracy w teście przeciwciał bezkomórkowych. b, Schemat badania przesiewowego AlphaLISA pod kątem przeciwciał neutralizujących przez współzawodnictwo z ACE2 SARS-CoV-2 RBD. c, Ocena komercyjnych przeciwciał neutralizujących (nAb) w przesiewie kompetycyjnym AlphaLISA ACE2 (n = 3 niezależne powtórzenia ± SEM). d, Porównanie zgłaszanej i mierzonej skuteczności komercyjnych przeciwciał neutralizujących.

Wykrywanie interakcji białko-białko za pomocą wysokowydajnej platformy do wykrywania przeciwciał

Zdolność wiązania przeciwciał-kandydatów wytworzonych przy użyciu systemów bezkomórkowych oceniono za pomocą niemal luminescencyjnego, amplifikowanego testu immunosorpcyjnego. Wysokowydajna metoda przesiewowa pozwala odróżnić interakcje białko-białko bezpośrednio od interakcji bezkomórkowej syntezy białek. Ponadto metoda niekowalencyjna stabilizuje białka będące przedmiotem zainteresowania na perełkach donora i akceptora, które po oddziaływaniach wytwarzają sygnał chemiluminescencyjny. Co ważne, technika ta może scharakteryzować bezpośrednie wiązanie antygenu, jak również konkurencyjne wiązanie specyficznych epitopów.

Analiza pięciu dostępnych na rynku przeciwciał ujawniła, że ​​ten test immunologiczny może określić zdolność przeciwciał do konkurowania z enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) o wiązanie z domeną wiążącą RBD SARS-CoV-2. Dodatkowe testy z ciężkimi i lekkimi łańcuchami fragmentu wiążącego antygen wykazały, że test jest bardzo spójny w przewidywaniu agregacji przeciwciał.

Skuteczność testu immunologicznego w charakteryzowaniu wiązania przeciwciała oceniano przy użyciu różnych paneli przeciwciał, o których wiadomo, że wiążą się z trymerem kolców, kolcem RBD lub rywalizują z ACE2 o wiązanie RBD. Eksperymenty te obejmowały zestaw 120 przeciwciał, które zostały już zidentyfikowane i przetestowane.

Wyniki ujawniły, że amplifikowany, luminescencyjny, zbliżeniowy, homodimeryczny test immunosorpcyjny jest wysoce skuteczny w specyficznym wykrywaniu przeciwciał, które wiążą się z segmentami przycinania kolców, kolcami RBD lub konkurują z ACE2 o wiązanie RBD.

Ponieważ ponad 90% przeciwciał neutralizujących działa poprzez blokowanie interakcji ACE2-RBD, w badaniu porównano współzawodnictwo ACE2 z neutralizacją wirusa. Wyniki wykazały, że test może konsekwentnie identyfikować silne przeciwciała neutralizujące dzięki mechanizmowi blokowania ACE2, jednak test wykazał niską skuteczność w charakteryzowaniu słabszych przeciwciał neutralizujących.

Wydajność przepływu pracy w teście przeciwciał bezkomórkowych oceniono na neutralizujących przeciwciałach SARS-CoV-2.  af, dane AlphaLISA przedstawiono jako średnie dla 3 niezależnych powtórzeń.  Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od sygnału tła.  ab, wcześniej opublikowaną mapę cieplną wiązania przeciwciała zmierzono za pomocą AlphaLISA w celu wykrycia wiązania trimeru S (skala log10), wiązania RBD (skala log10) i konkurencji ACE2 (skala liniowa).  Dane AlphaLISA są prezentowane jako średnia z trzech niezależnych powtórzeń.  Wykreślono również najniższą wartość IC neutralizacji zgłoszoną do porównania (skala log10), a X wskazuje na brak istotnych danych (tabela uzupełniająca 2).  Mapa cieplna wiązania 36 różnych przeciwciał.  b, Mapa cieplna wiązania wszystkich 84 przeciwciał w Brouwer et al.  zbiór danych.  cd, wykresy równoważności porównujące AlphaLISA z 84 przeciwciałami znalezionymi w Brouwer et al.  Zestaw danych a opublikowane dane ELISA.  Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od tła.  c, oprawa trymera S.  d, wiązanie RBD.  e, Porównanie danych wiązania pomiędzy trimerem S i RBD AlphaLISA.  f, Wykres równoważności porównujący dane konkurencji AlphaLISA ACE2 dla 84 przeciwciał w Brouwer et al.  Zestaw danych a opublikowane dane neutralizacji pseudowirusów.  Przeciwciała, o których doniesiono, że konkurują z ACE2 przez Brouwer et al.  W kolorze czerwonym.

READ  Miliardowa „luka” w zapisie geologicznym Wielkiego Kanionu spowodowana rozpadem starożytnego subkontynentu

Wydajność przepływu pracy w teście przeciwciał bezkomórkowych oceniono na neutralizujących przeciwciałach SARS-CoV-2. af, dane AlphaLISA przedstawiono jako średnie dla 3 niezależnych powtórzeń. Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od sygnału tła. ab, wcześniej opublikowaną mapę cieplną wiązania przeciwciała zmierzono za pomocą AlphaLISA w celu wykrycia wiązania trimeru S (skala log10), wiązania RBD (skala log10) i konkurencji ACE2 (skala liniowa). Dane AlphaLISA są prezentowane jako średnia z trzech niezależnych powtórzeń. Wykreślono również najniższą wartość IC neutralizacji zgłoszoną do porównania (skala log10), a X wskazuje na brak istotnych danych (tabela uzupełniająca 2). Mapa cieplna wiązania 36 różnych przeciwciał. b, Mapa cieplna wiązania wszystkich 84 przeciwciał w Brouwer et al. zbiór danych. cd, wykresy równoważności porównujące AlphaLISA z 84 przeciwciałami znalezionymi w Brouwer et al. Zestaw danych a opublikowane dane ELISA. Linia przerywana wskazuje trzy odchylenia standardowe od tła. c, oprawa trymera S. d, wiązanie RBD. e, Porównanie danych wiązania pomiędzy trimerem S i RBD AlphaLISA. f, Wykres równoważności porównujący dane konkurencji AlphaLISA ACE2 dla 84 przeciwciał w Brouwer et al. Zestaw danych a opublikowane dane neutralizacji pseudowirusów. Przeciwciała, o których doniesiono, że konkurują z ACE2 przez Brouwer et al. W kolorze czerwonym.

Przestudiuj znaczenie

Badanie opisuje rozwój i walidację wysokowydajnej zautomatyzowanej platformy do wykrywania przeciwciał, która wykorzystuje bezkomórkowe systemy testowe i ekspresyjne. Główną zaletą platformy jest szybki czas reakcji i wydajność. Na przykład pojedynczy badacz może scharakteryzować grupę 120 przeciwciał w ciągu 24 godzin przy użyciu tej metody.

Inną ważną cechą jest bezpośrednie profilowanie złożonych przeciwciał przy użyciu bezkomórkowych ekstraktów. Eliminuje to potrzebę procedur oczyszczania białek, które często stanowią etap definiujący w badaniach przesiewowych przeciwciał.

Jak donoszą naukowcy, ta wysokowydajna platforma może być wykorzystywana do szybkiej i łatwej identyfikacji silnych przeciwciał do zastosowań terapeutycznych, diagnostycznych i innych istotnych zastosowań badawczych.

READ  Łazik NASA Curiosity Mars Rover ujawnia nowe zrozumienie zapisu skalnego i dowody na możliwe oznaki starożytnego życia